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生物样品预处理

来源:lovebet手机版 作者:lovebet体育

  生物样品预处理的常用方法 以及最新进展 目录 1 2 3 生物样品预处理的目的 预处理的指导原则 常用的处理方法 处理方法简介 4 一、生物样品 生物样品的种类 血液 组织 器官 生物 样品 唾液 头发 尿液 其他 胆汁、乳汁、脑脊液、泪液、 精液、胃液、胰液、淋巴液、 粪便等。 一、生物样品预处理的目的 1.使药物从缀合物及结合物中释放出来,以测定药物的 总浓度。 2.生物样品介质组成复杂,干扰多,而药物组分是微量 的,必须先经过预处理,使纯化,富集。 3.为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度。 4.为了防止分析仪器的污染、劣化,提高测定灵敏度、 准确度、精密度和选择性等。 二、生物样品预处理的指导原则 生物样品进行预处理时应考虑到的问题: 1.药物的理化性质和存在性质 2.待测药物的浓度 3.药物测定的目的 4.选用的生物样品类型 5.样品预处理与分析技术的关系 二、指导原则-预处理应考虑问题 1.药物的理化性质和存在形式 A.酸碱性质、未电离分子的亲脂性、挥发性:涉及药物 的提取性质、是否挥发损失以及能否采用GC法 a.较亲脂的药物:可用溶剂萃取,也可用烷基键和相 硅胶、大孔吸附树脂及亲水型填料SPE等方法。 b.亲水性较强且有酸碱性、可电离药物:离子交换柱 和离子对液液萃取等。 c.亲水性较强但不能电离药物:沉淀蛋白 二、指导原则-预处理应考虑问题 1.药物的理化性质和存在形式 B.药物在体内的存在形式及蛋白结合率: a.结合蛋白率高: 首先去蛋白 b.多为代谢缀合物:缀合物水解 C.药物的光谱特性及官能团特性:涉及分析仪器 的选择以及是否需要衍生化和特殊检测器。 紫外吸收强弱:是否用UV检测器 含有-NO2 、-Cl等电负性基团:ECD检测器 二、指导原则-预处理应考虑问题 1.药物的理化性质和存在形式 D.药物的稳定性: a.易氧化药物:加入抗氧剂 b.易被光分解药物:避光 c.易被酯酶水解药物:对酶进行灭活 二、指导原则-预处理应考虑问题 2.待测药物的浓度 浓度越大,预处理要求越低;反之,浓度越小, 预处理要求越高。例如,地高辛的治疗血药浓度 为1-2ng/ml,而水杨酸的治疗血药浓度为20100μg/ml。 3.药物测定的目的 a.急性中毒病例:快速鉴定所怀疑的药物,尽 可能短时间测得。预处理可粗放些。 b.分别获得酸性、中性或碱性代谢物:要考虑 全面、细致 二、指导原则-预处理应考虑问题 4.选用的生物样品类型 血浆、血清:除蛋白然后提取 唾液:离心去粘蛋白 尿液:酸水解或酶水解法使缀合物水解 头发:有机破坏 5.样品预处理与分析技术的关系 样品预处理需要的净化程度与所用分析 方法是否专属、是否具有分离能力、检 测系统对杂质污染的耐受程度有关。 三、常用的处理方法 常用方法 1.有机破坏法 2.除蛋白法 3.缀合物的水解 4.分离,纯化 与浓集 5.衍生化法 重点介绍 除蛋白法 液液萃取法 三、常用的处理方法-有机破坏法 1.有机破坏法 特 点 样 品 1、硫酸作为分解剂(消化剂),加氧化剂 血、尿、 硝酸 — 高氯酸法 (硝酸、高氯酸、过氧化氢等)作辅助分解剂。 组织 2、破坏能力强,反应比较激烈,操作时, 电热消化器法 应在通风橱内进行。 3、先低温反应,再高温蒸发,以免发生爆 电热板消化法 炸; 人发 4、所得的无机金属离子,一般为高价态。 烘箱消化法 1、适用于卤素、硒、硫、磷等微量元素分 高温炽灼法 析的前处理 2、高温炽灼法:坩埚,先完全炭化,再灰 化,盐酸溶解定容。盐酸加无水碳酸钠或氧化 血、人 氧瓶燃烧法 镁等以助灰化。(高温电子炉、低温等离子) 发 3、氧瓶燃烧法:密闭的燃烧瓶中进行燃烧, 选择适当吸收液。 分 类 湿法 破坏 干法 破坏 三、常用的处理方法-除蛋白法 蛋白质 沉淀 酶解法 去除蛋白 三、常用的处理方法-除蛋白法 1.蛋白质沉淀 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为 蛋白质沉淀(precipitation),变性蛋白质 一般易于沉淀,但也可不变性而使蛋白质 沉淀,在一定的条件下,变性的蛋白质也可 不发生沉淀。 破 坏 表面水化层 蛋白质亲水胶体颗粒 表面电荷 破 坏 调节pH至等电点 凝集析出 加入脱水剂 三、常用的处理方法-除蛋白法 测定血样时,首先应去除蛋白质。 去除蛋白质作用: a.可使结合型药物释放出来,以便 测定药物的总浓度; b.可预防提取过程中蛋白质发泡, 减少乳化的形成; c.可保护仪器性能(如保护 HPLC柱 不被污染),延长使用期限。 三、常用的处理方法-除蛋白法 1.蛋白质沉淀方法 溶剂解法 盐析和脱水 加入中性盐 蛋白质沉淀 加入强酸 生成不溶性盐沉淀 加入重金属沉淀剂 三、常用的处理方法-除蛋白法 A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂,可使蛋白质分子内及分子 间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚,使与蛋白质结 合的药物释放出来。 常用的水溶性有机溶剂有:乙腈、甲醇、乙醇、丙 醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水 溶性有机溶剂的体积比为1:(1~3)时,就可以将 90%以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不 同时,析出的蛋白质形状亦不同;并且所得上清液 的pH值也稍有差别,如用乙腈或甲醇时,上清液pH 为8.5~9.5,用乙醇或丙酮时,上清液pH为9~10。 三、常用的处理方法-除蛋白法 A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂 操作步骤: a.水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合 b.离心分离,采用超速离心机(10000r/min)离 心1~2min。(使用具塞塑料尖底管) c.取上清液作为样品。 将蛋白质粘牢在 管底,便于吸取 上清液 三、常用的处理方法-除蛋白法 A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂 优点:1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂 只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀; 2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易; 3)在生化制备中应用比盐析法广泛。 缺点:对具有生物活性的大分子容易引起变性失活, 操作要求在低温下进行。总体来说,蛋白质和 酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。 三、常用的处理方法-除蛋白法 B.加入中性盐 加入中性盐,使溶液的离子强度发生变化。中性盐 能将与蛋白质水合的水置换出来,从而使蛋白质脱 水而沉淀。 常用的中性盐有:饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷 酸盐及枸橼酸盐等。 操作:a.按血清与饱和硫酸铵的比例为1:2混合; b.离心(10000r/min)1~2min,即可除去90%以 上的蛋白质。 c.得上清液的pH为7.0~7.7。 三、常用的处理方法-除蛋白法 B.加入中性盐 ? ? ? ? ? ? 优点: 药物的回收率高; 不引起蛋白质变性。 注意事项 : 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度, 溶液pH值越接近蛋白的等电点,蛋白质越容易沉淀。 三、常用的处理方法-除蛋白法 C.加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时,蛋白质以阳离子形式 存在。此时加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶 性盐而沉淀。 常用的强酸有:10%三氯醋酸、6%高氯酸、硫酸钨酸混合液及5%偏磷酸等。 三、常用的处理方法-除蛋白法 C.加入强酸 操作: a.含药物血清与强酸的比例为1:0.6混合; b.离心〈10000r/min)1~2min(可以除去90%以上的蛋白质) c.取上清液作为样品。 优点:该方法去蛋白迅速简单, 且而所需样品量少, 组分极少变化。 分析:过量的三氯醋酸可经煮沸,分解为氯仿和二氧化碳而被除去; 也有用提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳 酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和,然后加乙醇使产生的高氯 酸钾(钠)沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去。 因加入了强酸,上清液呈酸性(pH0~4),在酸性条件下易 分解的药物不宜用本法除蛋白。 三、常用的处理方法-除蛋白法 D.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 ? 当pH高于蛋白质的等电点时,金属阳离子与蛋白质 分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。 常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。 离心分离后所得的上清液pH分别为5.7~7.3和6.5~7.5。 优点: 可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处 理后进样,简化操作。 ? ? ? 三、常用的处理方法-除蛋白法 2.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时,常需 用酶解法。 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。 它不仅可使组织溶解,并可使药物析出。枯草菌溶素是 一种细菌性碱性蛋白分解酶,可在较宽的pH范围( PH7.0~11.0)内使蛋白质的肽键降解,在50~60℃ 具有最大活力。 三、常用的处理方法-除蛋白法 2.酶解法 操作:先将被测组织加Tris-缓冲液pH 10.5及酶, 60℃培育1h,用玻璃棉过滤,得澄清滤液, 即可供药物提取用。 优点:可避免某些药物在酸及高温下降解;对与 蛋白质结合牢的药物(如保泰松、苯妥英钠), 可显著改善回收率;可用有机溶剂直接提取 酶解液而无乳化现象生成,当采用HPLC法检 测时,无需再进行过多的净化操作。 不足:不适用于在碱性下易水解的药物。 三、常用的处理方法-缀合物的水解 ? 缀合物:药物或其代谢物与内源性物质结合生成 的产物。 ? 内源性物质: a.葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸 等; b.一些含有羟基,羧基,氨基和巯基的药物,可 与内源性物质葡萄糖醛酸结合形成葡萄糖醛酸 苷缀合物; c.一些含酚羟基,芳胺及醇类药物与内源性物质 硫酸形成硫酸酯缀合物。 三、常用的处理方法-缀合物的水解 特点:多用于尿中药物或其代谢物;缀合物极性 较大,不易被有机溶剂提取。 常用方法: a.酸水解:适量盐酸(条件因药而异) b.酶水解:常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或两者 的混合酶,一般控制pH值在4.5~5.5, 37℃培育数小时。 三、常用的处理方法-缀合物的水解 b.酶水解法 温和 专属性强 费用高 特点 时间长 带入粘蛋白导致乳化 带入粘蛋白阻塞色谱柱 四、常用的处理方法-分离、浓集、纯化 (一)液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE) 是传统的分离、分析方法,据检测灵敏度要求,提取后 一般需浓集。 传统浓集方法: a.在末次提取时加入的提取液尽量少,使被测组分提取 到小体积溶剂中,然后直接吸出适量供测定。 b.挥去提取溶剂法。挥去溶剂时应避免直接加热,防止 被测组分破坏或挥发损失。挥去提取溶剂的常用方法 是直接通入氮气流吹干;对于易随气流挥发或遇热不 稳定的药物,可采用减压法挥去溶剂。 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 原理: 多数药物是亲脂性的,在适当的有机溶剂中的溶解度 大于在水相中的溶解度,而血液或尿液中含有的大多 数内源性杂质是强极性的水溶性杂质。因而用有机溶 剂提取一次即可除去大部分杂质,从大量的样品中提 取药物经浓集后作为分析样品。 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 操作: ? ? 萃取一次,不采用反复萃取的方法。 特殊情况(杂质不易除去,萃取液难以挥发干扰测 定),用一定pH值的水溶液对含药有机相进行反萃 取(back extraction) 萃取率不低于50%即可。 萃取前加入等量内标。 ? ? 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 影响萃取的因素 影响萃取的因素:有机溶剂的特性、有机溶剂相与水相的 体积及水相的pH值等 1.溶剂的选择与纯度要求 a.提取率和选择性 b.操作是否方便。 选择溶剂时应注意以下几点: ①要了解药物与溶剂的化学结构和性质,根据相似 相溶的原理进行选用 ②要求对药物的未电离分子可溶,而对电离形式的 分子不溶 ③沸点低,易挥散、浓集 ④无毒、不易燃烧 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 影响萃取的因素 选择溶剂时应注意以下几点: ⑤与水不相混溶,如,萃取后可混入约1.2% 的水份,可能带入一些水溶性杂质。萃取 能力强,易于挥散、浓集、为常用萃取溶剂, 可采用无水碳酸钠脱水,减少混入的水溶性杂 质量 ⑥不易形成乳化 ⑦具有较高的化学稳定性和惰性 ⑧不影响紫外检测 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 影响萃取的因素 提取溶剂: 溶剂名称 正己烷 环己烷 四氯化碳 苯 甲苯 甲基叔丁基醚 异丙醚 氯仿 1,2-二氯乙烷 甲基异丁基酮 乙酸乙酯 正丁醇 异丙醇 沸点(℃) 密度(g/ml) 备注 69 0.66 81 0.78 77 1.6 肝脏毒性 80 0.88 致癌性 111 0.87 沸点过高,调节极性用 55 0.74 含过氧化物 68 0.73 含过氧化物 35 0.71 含过氧化物 61 1.5 肝脏毒性,致癌作用 83 1.26 116 0.8 沸点过高,调节极性用 77 0.9 118 0.81 沸点过高,调节极性用 83 0.79 极 性 增 加 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 影响萃取的因素 2.有机溶剂相和水相的体积 a.有机相与水相(体液样品)容积比为1:1或2:1。 b.在实验中考察有机溶剂的最佳用量。 3.水相的pH值 a.一般规则来说,碱性药物在碱性pH值,酸性药物在酸性pH值介 质下提取; b.生物样品一般多在碱性下提取; c.一些碱性药物在碱性pH不稳定时,则在近中性pH处用氯仿和异 丙醇提取; d.中性药物在pH7附近提取。 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 液液萃取法 优点:操作方便;具有选择性,药物能与多数内源性物质分离,尤其 在使用非专属性的光谱分析时,这一优点更为突出,但这依赖 有机溶剂的选择。 缺点:a.产生乳化现象,引起药物损失,导致回收率较低; b.有机溶剂易挥发、有毒性、对环保不利; c.不能自动化。 注意:1.防止乳化现象的产生 a.采用较大体积的有机溶剂进行提取; b.在提取前于水中加入固体氯化钠; c.轻微乳化时,适当转速离心; d.严重乳化时,置低温冰箱中使水相快速冻凝,破坏乳化 层再溶化后离心。 2.减少吸附 a.加入异戊醇 b.加入二乙胺 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 液液萃取法-离子对萃取法 离子对萃取法是用有机溶剂提取离子性药物的方法。 原理: 亲水 性极 强 用有机溶剂 从水相萃取 离解 酸或碱性药物 体液中 带电荷离子 加入反离子 脂溶性离子对 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 离子对萃取法 离子对试剂 的选择 碱性药物 烷基磺酸类化合 物(RSO3H) 戊烷磺酸 己烷磺酸 庚烷磺酸 月桂磺酸 酸性药物 烷基季铵类化合 物(R4N+· X-) 四丁基铵 四乙基铵 四辛基铵 常用的提取溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷等。 四、分离、浓集、纯化-液液萃取法 应用 1 体液中呈阴离 子状态的药物 及代谢物 2 体液中能离 解成阳离子 的药物 3 尿液中水溶性 大的葡萄糖醛 酸苷和硫酸酯 缀合物

2022-01-25 09:44:15
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